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电泳槽组装 怎样组装电泳槽?

1, 怎样组装电泳槽?



一、组成部件
(一)装有铂金丝的贮液槽一对,配有冷却装置及电泳缓冲液流出口。
(二)凹型橡胶框,配有玻璃板,可分别制作厚度为lmm、1.5mm的凝胶板,操作时根据需要选择适当厚度的玻璃板及梳子配套使用。
(三)样品孔模具(梳子)用于电泳加样。
(四)固定贮液槽的螺丝杆及螺母4对,28D、30型为5对。
(五)橡胶管五根。两根长的用于连接冷却水的出入口;中等长度的两根用于连接电极缓;中液的流出口;最短的一根用于连接贮液槽间的冷却水。
(六)导线1付。

二、使用方法
(一)清洗部件
上述部件组装前要彻底清洗干净。尤其是玻璃板及凹形带槽橡胶框,必须用泡沫海绵沾少许肥皂粉或洗涤剂彻底清洗干净。清洗后的玻璃板应放在玻璃板支架上晾干水后方能使用。
(二)组装电泳槽
A、1、将四只固定螺杆插进一只贮液框(半上槽)的相应孔洞中,然后将贮液框仰放在桌上。
2、左手拿凹型槽橡胶模框,右手的拇指与中指握住玻璃板的两侧边缘插到橡胶模框内 (注意手指不能接触灌胶面的玻璃板)。
3、将带有玻璃的橡胶模框子放在仰放的贮液槽框架上,其下缘必须对齐贮液槽框下缘。
4、双手拿另一只贮液槽框与仰放在桌上的贮液槽框相合,并使橡胶框上的凸出线位于贮液槽有机玻璃框中央。
5、装上四只螺母,拧紧螺丝。注意拧紧螺丝时用力应均匀,最好用双手按斜角位置双双逐渐拧紧。
6、将电泳槽垂直竖起,放在桌上,带短玻璃板的贮液槽称上槽(阴极端),带长玻璃板的贮液槽称为下槽(阳极端),在长玻璃板与橡胶框间有一缝隙。此缝隙可用已熔化的10%琼脂沿长玻璃板下端灌入,为防止留存气泡,可稍抬起一端即可赶去气泡。待琼脂完全凝固后才能灌胶。
B、也可将槽垂直竖起,将带有玻璃的橡胶模框直接放入槽中,对称拧紧螺丝后,用琼脂封底边。
(三)灌胶
1、先灌分离胶,待凝固后再灌浓缩胶。灌胶前接通冷却水,夹紧连接上下贮液槽的两根橡胶管。
2、用细头滴管吸取胶液,沿长、短玻璃板中间缝隙从一端加入胶液。为防止产生气泡,可稍拾起另一端(气泡往高处走),不断加入胶液。若单层胶(分离胶)则加胶量约距离短玻璃板上端0.3厘米处,轻轻加少许水,双手轻轻将梳子插入,待胶凝后就可形成凹形加样孔。
3、为防止漏胶,在上、下贮液槽中立即加入蒸馏水,但蒸馏水不能超过短玻璃板上缘。
4、胶凝固后即可看到样品槽梳子与凝胶板间有一层折
射率不同的亮区。
(四)加样
1、松开连接上、下贮液槽两根橡皮管上的夹子,放掉槽内的蒸馏水,待水流完后,再夹紧夹子。
2、双手轻轻取出样品梳子,即可看到界线清楚的加样孔,将孔中水分吸去(注意千万不要碰坏孔沿的字面)。
3、在上、下贮液槽中加入缓;中液,液体高度应超过上贮液槽短玻璃板上缘。
4、用微量注射器吸取一定量的样品加到长、短玻璃板间的凹型凝胶样品孔内(注意加样动作要轻,针头不能碰坏胶面)。
(五)电泳
一贮液槽导线与电泳仪的负极相连,下贮液槽导线与电泳仪的正极相连。检查线路无误,方可按照所要求的电压电流进行电泳。
(六)取出胶板
电泳结束,旋松螺母,取出胶框,剥出玻璃板,在两块玻璃板下角空隙内,用刀片背面轻轻撬动,即可将胶面与一块玻璃板分开,将有胶板的玻璃板平放在桌上,双手轻轻沿凝胶底将胶片托起,放在大培养皿中染色,胶板经漂洗、脱色后即可看到清晰的分离条带。
注:DYCZ—28B、29型夹芯式电泳槽使用方法与此相同。DYCZ—28C型、28D型和30型电泳槽使用方法也与此相同,因是制作两块胶板,故实际形成三个贮液槽。请注意在操作时两个胶室的短玻璃板都要向里,中间为负极,两边为正极。
注意.可作两块胶的电泳槽,在作一块胶时,应将三头导线都插在电泳槽上,以免放在桌上误碰。

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一。操作步骤:
1、电泳方法
一般的核酸检测只需要琼脂糖凝胶电泳就可以;如果需要分辨率高的电泳,特别是只有几个bp的差别应该选择聚丙烯酰胺凝胶电泳;用普通电泳不合适的巨大DNA链应该使用脉冲凝胶电泳。
2、凝胶浓度
对于琼脂糖凝胶电泳,浓度通常在0.5~2%之间,低浓度的用来进行大片段核酸的电泳,高浓度的用来进行小片段分析。低浓度胶易碎,小心操作和使用质量好的琼脂糖是解决办法。
3、缓冲液
常用的缓冲液有TAE和TBE,而TBE比TAE有着更好的缓冲能力。电泳时使用新制的缓冲液可以明显提高电泳效果。
4、电压和温度
电泳时电场强度不应该超过20V/cm,电泳温度应该低于30℃,对于巨大的DNA电泳,温度应该低于15℃。
5、DNA样品的纯度和状态
注意样品中含盐量太高和含杂质蛋白均可以产生条带模糊和条带缺失的现象。乙醇沉淀可以去除多余的盐,用酚可以去除蛋白。
6、DNA的上样
正确的DNA上样量是条带清晰的保证。注意太多的DNA上样量可能导致DNA带型模糊,而太小的DNA上样量则导致带信号弱甚至缺失。
7、Marker的选择
DNA电泳一定要使用DNA Marker或已知大小的正对照DNA来估计DNA片段大小。Marker应该选择在目标片段大小附近ladder较密的,这样对目标片段大小的估计才比较准确。
8、凝胶的染色和观察
实验室常用的核酸染色剂是溴化乙锭(EB),染色效果好,操作方便,但是稳定性差,具有毒性。注意观察凝胶时应根据染料不同使用合适的光源和激发波长,如果激发波长不对,条带则不易观察,出现条带模糊的现象。
1、巨大的DNA链用普通电泳可能跑不出胶孔导致缺带。
2、高浓度的胶可能使分子大小相近的DNA带不易分辨,造成条带缺失现象。
3、电泳缓冲液多次使用后,离子强度降低,pH值上升,缓冲性能下降,可能使DNA电泳产生条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。
4、如果电泳时电压和温度过高,可能导致出现条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。特别是电压太大可能导致小片段跑出胶而出现缺带现象。
5、变性的DNA样品可能导致条带模糊和缺失,也可能出现不规则的DNA条带迁移。在上样前不要对DNA样品加热,用20mM NaCl缓冲液稀释可以防止DNA变性。
6、太多的DNA上样量可能导致DNA带型模糊,而太小的DNA上样量则导致带信号弱甚至缺失。
参考资料来源:百度百科-琼脂糖凝胶电泳

名词解释


DNA

脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic acid,缩写为DNA),简称DNA,是一种最重要的生命基础分子,可组成遗传指令,以引导生物遗传、生物发育与生命机能运作。 DNA是一种长链聚合物,其基本组成单位称为核苷酸,其中的脱氧核糖与磷酸借由酯键相连,组成DNA长链的骨架。每个糖单位都会与某一种碱基相连,组成生物界DNA的碱基主要有四种,分别称为A、T、C、G,这些碱基沿着DNA长链排列,形成的序列,即是遗传信息,用以指导RNA的合成,进而指导蛋白质的合成。

电泳

带电颗粒在电场作用下,向着与其电性相反的电极移动,称为电泳(electrophoresis, EP)。利用带电粒子在电场中移动速度不同而达到分离的技术称为电泳技术。 1807年,由俄国莫斯科大学的斐迪南·弗雷德里克·罗伊斯(FerdinandFrederic Reuss)最早发现。 1936年瑞典学者A.W.K.蒂塞利乌斯设计制造了移动界面电泳仪 ,分离了马血清白蛋白的3种球蛋白,创建了电泳技术。

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